流式細(xì)胞數(shù)檢測(cè)PBMCs中Th17/Treg細(xì)胞比例：
分離小鼠PBMCs后，按工作濃度加入佛波酯，Ionomycin，Monensin，37°C孵育4~6h，設(shè)同型對(duì)照管和檢測(cè)管。Fc受體阻斷劑封閉后，分別加入CD4表面抗體染色，混勻，室溫避光孵育15min后每管按操作要求先后加入固定液和破膜/溶血液，洗滌后實(shí)驗(yàn)管分別加入2種配色抗體，對(duì)照管加入同型對(duì)照抗體。避光孵育后，加入洗滌劑離心棄上清，重懸細(xì)胞，24h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。以CD4直方圖射門，以散點(diǎn)圖染色陽(yáng)性表示Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞，用Cellsquest軟件獲取并分析數(shù)據(jù)。（一個(gè)樣本分為兩種染色方案，Th17：CD4-FITC、IL-17-PE；Treg：CD4-FITC、CD25-APC、Foxp3-PE）

RT-PCR檢測(cè)PBMCs中FOXP3、RORrt、STAT3、STAT5的表達(dá)：
分別提取各組PBMCs總RNA，并進(jìn)行RNA純度和完整性鑒定；設(shè)計(jì)引物，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以β-actin為內(nèi)參，然后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR；采用相對(duì)定量法利用Ct計(jì)算FOXP3、RORrt、STAT3、STAT5 mRNA的相對(duì)量。

1.HE染色觀察局部組織細(xì)胞病理結(jié)構(gòu)改變：
取各組小鼠蛻膜組織，包埋石蠟切片，HE染色。
2.電鏡觀察局部組織細(xì)胞凋亡和病理結(jié)構(gòu)改變：
無(wú)菌取各組小鼠蛻膜組織，加入2.5%戊二醛進(jìn)行預(yù)固定，1%鋨酸進(jìn)行后固定，再逐級(jí)用乙醇和丙酮進(jìn)行脫水，樹脂包埋，制備成超薄切片，醋酸雙氧鈾-硝酸鉛溶液進(jìn)行雙重染色，置投射電鏡下進(jìn)行觀察。
3.免疫組化分析局部組織細(xì)胞因子STAT3、STAT5表達(dá)：
4.RT-PCR檢測(cè)蛻膜組織中的FOXP3、RORrt、STAT3、STAT5 mRNA表達(dá)。
5.Western blot檢測(cè)蛻膜組織中的STAT3、STAT5蛋白表達(dá)

6.1ELISA檢測(cè)脫膜組織勻漿中的IL-2、IL-6。
收集各組蛻膜組織，組織勻漿后取上清進(jìn)行ELISA檢測(cè)。

6.2ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子IL-2、IL-6和TGF-β1表達(dá)：
取各小鼠血清，使用IL-2、IL-6和TGF-β1 ELISA kit，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，在酶標(biāo)儀上設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線，每個(gè)標(biāo)本和標(biāo)準(zhǔn)品均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。用酶標(biāo)儀讀取血清樣本的吸光度值（A），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本濃度值。

應(yīng)用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x ±ｓ）表示，采用ｔ檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05表示有顯